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运动对大鼠纹状体DA含量及AMPA受体亚基表达可塑性的影响

作者:陈东方,毕妍,孙雪 来源:首都体育学院学报 论文栏目:体育论文     更新时间:2019-07-10   浏览

原文标题:《运动对大鼠纹状体DA含量及AMPA受体亚基表达可塑性的影响》,作者:陈东方,毕妍,孙雪,该学术论文发表于:首都体育学院学报,2017年6期 ,由论文网在线小编整理。

陈东方,,毕妍,,孙雪

摘 要:觀察中等运动强度对纹状体内多巴胺(dopamine,DA)含量及ɑ-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体表达的影响,探求运动促进脑可塑性的机制。方法:清洁级SD大鼠62只分为4组:安静对照组(Sham)、运动7 d组(Ex7)、运动14 d组(Ex14)和运动28 d组(Ex28)。适应性饲养1周后开始进行跑台训练,运动方案为11 m/min,30 min/day。采用Panlab系统观察运动对大鼠自主活动能力的影响;采用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)观察纹状体DA含量,采用免疫组织化学和Western-blotting观察运动对纹状体AMPA受体的GluR1和GluR2/3亚基表达水平的影响。结果:采用Smart 3.0软件分析大鼠自主活动能力结果发现,长期(第14和28 d)运动训练可以显著增加大鼠自主活动能力(P<0.01);HPLC结果发现Ex28组较Sham组DA含量显著升高(P<0.01),而Ex14和Ex7组较Sham组无显著改善(P>0.05);免疫组织化学检测的结果发现,长期(第14和28 d)运动干预可以显著增加GluR1和GluR2/3亚基的表达(14 d:P<0.05,28 d:P<0.01),短期运动(第7 d)较Sham组无显著改善(P>0.05)。结论:跑台运动可以显著提高大鼠的自主活动能力及纹状体DA含量和GluR1和GluR2/3亚基的表达水平,对纹状体神经递质含量和受体表达产生可塑性影响。推测:DA含量提升和AMPA受体亚基表达的改变是运动提升大鼠运动表现的重要基础之一,可能是运动改善学习记忆、认知和行为的可塑性机制之一。

关键词:运动;纹状体;多巴胺;AMPA受体;大鼠;可塑性

中图分类号:G 804.2 文章编号:1009-783X(2017)06-0561-04 文献标识码:A

Abstract: Objective: To study the plasticity mechanism of moderate exercise on the brain structure, we investigated the expression of the AMPA receptor subunits (GluR1 and GluR2/3) and dopamine contents in striatum. Methods: Sixty-two adult male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups according to duration of treadmill exercise, namely 7 days (Ex7), 14 days (Ex14), 28 days (Ex28) and Sham groups. All the rats in the exercise group were forced to run on a motorized treadmill (11 m/min for 30 min each day). As behavioral evaluations, autonomic movement were recorded by the Panlab system. After exercise, the brains were subjected to immunohisochemistry and immunoblotting to analyze changes of GluR1 and GluR2/3. Animals in high-performance liquid chromatography (HPLC) experiment group were used to test dopamine contents in striatum. Results: After exercise, the automatic movement of rats in the exercise group significantly increased in Ex14 and Ex28 compared with the Sham group(P<0.01). HPLCresults indicated that dopamine in Ex28 group were higher than in Sham group(P< 0.01), but there are no significant changes between Ex7 and Ex14 compared with Sham rats(P > 0.05). There was an increased expression of GluR2/3 and a decreased GluR1 expression in Ex14 and Ex28 groups compared with the Sham group(Ex14: P < 0.05; Ex28: P < 0.01) while Ex7 groups did not(P>0.05). Conclusion: Our research show that the exercise protocol used is able to promote plastic GluR expression and dopamine contents during exercise, suggesting a specific involvement of these receptors in exercise-induced plasticity processes in brain.

Keywords: exercise; striatum; dopamine; AMPA receptor; rat; plasticity

过去的几十年中,运动对大脑可塑性影响的研究广泛开展。众多基础研究表明,运动训练可以对正常或受损大脑神经元的结构和功能产生可塑性影响,且运动介导的脑可塑性与运动强度和运动持续时间有关[1-2]。纹状体在运动技能学习及动作执行过程中起重要作用,多巴胺(dopamine,DA)和谷氨酸(glutamate,Glu)是调控纹状体功能状态的2类主要神经递质。研究表明,DA系统是成瘾和奖赏行为的重要神经基础,运动成就和欣快感也是由DA系统介导,适宜的运动形式和强度对DA系统的可塑性影响是改善脑健康的重要机制。Glu通过与相关受体结合激活Ca2,内流引起细胞去极化,从而使胞内的酶活化产生级联反应,该过程是脑神经可塑性产生的结构基础之一。Glu的受体并不是突触的静态组件,AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor,AMPAR)受体通过与后膜的结合与分离完成信息传递,其亚基(GLuR1和GluR2/3)在突触可塑性和动作技能学习方面具有直接的作用[3]。AMPA受体参与中枢神经系统的快速兴奋突触传递,对正常的脑功能维持起着重要作用[4-5],其亚基表达的改变是突触可塑性发生的结构基础,这可能是运动影响学习记忆、认知和行为的可塑性机制之一[6]。纹状体DA减少或AMPA受体亚型表达的病理改变是许多神经退行性疾病的发病基础,二者的可塑性改变可能是运动促进脑健康的机制之一。作为运动干预介导可塑性的重要作用靶点,DA含量与AMPA受体表达的改变与运动促进脑健康的神经机制密切相关。为此,本研究采用HPLC和免疫组织化学及免疫印迹的方法,分别观察了不同运动持续时间的中等运动强度对大鼠纹状体DA含量及AMPA受体亚基(GluR1和GluR2/3)表达的影响,探求运动训练促进大脑可塑性的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料

实验选用健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体质量220~240 g,由北京大学医学部实验动物科学部提供,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2011-2012。大鼠在标准环境中分笼饲养,适应性饲养1周后,随机分假手术安静组(Sham,n=14)、7 d运动组(Ex7,n=16)、14 d运动组(Ex14,n=16)和30 d运动组(Ex28,n=16)。

1.2 运动干预方案

采用Tajiri [7]等提出的中等强度匀速跑台运动方案,大鼠执行该强度时心率为65%~75% 的最大心率。运动方案为:11 m/min,30 min/day[7]。实验设计如图1所示。

1.3 行为学测试

采用Panlab系统进行自主能力测试实验,用于评估大鼠的运动能力。每只大鼠放于直径50 cm的实验箱的中央,让大鼠自由活动5 min,摄像头同步记录其在箱体的活动。采用Smart 3.0 软件分析5 min内大鼠自主活动时间、静止时间和精细动作时间所占比例。参照Alexxai [8]行为学实验,自主活动时间是指动物平均中心速度大于2 cm/s且持续时间超过0.5 s;静止时间是指动物静止的时间不小于1 s;精细动作时间包括理毛、站立等特殊精细行为。

1.4 免疫组化实验

各组大鼠在实验结束后的第2 天,用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,灌流取脑,脑组织置于4%多聚甲醛中固定12 h。固定好后分离纹状体,梯度酒精脱水、二甲苯中透明2次,石蜡包埋备用。蜡块连续冠状切片,每6张选1张,片厚5 μm。顺序贴片、烤片、脱蜡及水化。PBS冲洗、抗原修复后滴加3%双氧水在载玻片上,封闭20 min,加入GluR1和GluR2/3的一抗(1∶100,Chemicon,Temecula,CA,USA)4 ℃孵育过夜,37 ℃复温20 min,PBS冲洗,加入二抗(1∶200,Proteintech Group,USA),室温孵育1 h,PBS冲洗3次。DAB显色剂染色,PBS冲洗后采用苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。采用奥林巴斯显微镜对纹状体背外侧区域拍照。采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫阳性细胞计数。

1.5 Western blot

各组大鼠在试验结束后的第2 天,断头取脑,于冰上快速分离纹状体,置于-80 ℃的冰箱。检测时取出组织置于预冷的研钵体中碾碎,转入EP管,加入组织裂解液,匀浆后离心,取上清液样品,测定总蛋白含量,另取上清液 样品置于-80 ℃冰箱保存。样品经10%SDS-PAGE胶分离后,经4 ℃、18 V恒压1 h;在一抗溶液中4 ℃孵育过夜,漂洗后在HRP标记的二抗溶液中室温孵育60 min,β-actin作内参。ECL检测胶带,X光胶片曝光、冲洗。将胶片进行扫描,用凝胶图像处理系统分析目标带积分光密度值(IOD)。

1.6 纹状体DA含量高效液相色谱-电化学联测法检测

所有实验结束后24 h,用10%水合氯醛(4.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,斷头取脑,准确称量纹状体质量,以1∶9(体积分数)加入生理盐水,玻璃匀浆器冰浴匀浆,离心取上清液,以1∶2(体积比)加入0.4 mol/L高氯酸去蛋白,低温下取上清液,加入碳酸钾溶液稀释后低温离心,取上清液,加入衍生剂,混匀待测。

标准溶液的配制:精确称取DA 0.5 mg→用dd H2O稀释至0.5 mL→制成1 μg/μL的贮备液→取10 μL,加流动相990 μL稀释→10ng/μL的贮备液→取40μL,加流动相稀释至500 μL→用流动相倍比稀释得6个浓度梯度:8、4、2、1、0.5 ng/20 μL。色谱条件:色谱柱为ODS-SP反相色谱柱(4.6×150 mm,5 μm),流动相:V(甲醇)∶V(双蒸水)=1∶9,其中ddH2O中每升含NaH2PO4 0.1 mol/L,EDTA·2Na(2H2O) 0.027 mmol/L,辛烷磺酸钠0.74 mmol/L,Kcl 2 mol/L;流速为0.25 mL/min,柱温为35 ℃,调节PH为3。上样分析,绘制标准曲线及含量计算:1)设定ECD电压为0.65 V, 样品流量1.0 mL/min,每一样品检测时间为35 min;2)将标准品依次进样,检测并且记录其保留时间作为定性指标;3)将5种浓度的标准品混合并稀释,然后依次进样,检测并绘制标准曲线,求出直线回归方程,得出相应含量。

1.7 数据处理

应用sigmaplot 13.0统计软件对所得数据进行统计学计算,数据以平均值±标准差表示,各组间比较采用双因素方差分析(Two-Way ANOVA),组间多重比较采用LSD检验,显著水平为P<0.05。

2 结果

2.1 自主活动能力测试结果

自主活动能力测试结果显示:与Sham组相比,Ex7和Ex14组的大鼠静止状态和精细动作所占时间比例没有显著性改变(P>0.05);但Ex14组大鼠的自主活动时间所占时间比例显著升高(P<0.05),而Ex28组,大鼠自主活动和精细动作的时间所占比例显著升高(P<0.01,P<0.05),静止状态的时间显著降低(P<0.01),如图2所示。

2.2 免疫组化结果

免疫组化结果显示如图3所示:与Sham组相比,Ex14和Ex28組的纹状体GluR1表达均上调,差异具有显著性(Ex14组P<0.05,Ex28组P<0.01);而Ex7组的表达没有显著性差异(P>0.05)。与Sham组相比,Ex14和Ex28的GluR2/3的表达显著上调,差异具有显著性(Ex14组P<0.05,Ex28组P<0.01);而Ex7组的表达没有显著性差异(P> 0.05)。

2.3 Western-blotting 结果

Western-blotting结果显示,Ex7组的纹状体GluR1与GluR2/3的表达与Sham组相比均无显著性差异(P>0.05);而与Sham组相比,Ex14与Ex28组的纹状体GluR1和GluR2/3的表达水平均显著上调,且差异具有显著性(Ex14组P<0.05,Ex28组P<0.01)。Western-blotting的结果显示,各组大鼠GluR1和GluR2/3的免疫组织化结果趋势一致。

2.4 大鼠纹状体内DA含量变化

各组大鼠纹状体内DA水平如图5所示,与Sham组相比,Ex7和Ex14组纹状体内的DA水平均无显著性改变(P>0.05),而Ex28组的DA水平显著升高(P<0.01)。

3 讨论

纹状体是基底神经节最大的信息输入核团,它接受来自黑质DA能及皮层和丘脑的Glu能的投射,DA是儿茶酚胺类神经递质的一种,它参与认知、情感、内分泌等多种功能的调控[9];皮层-纹状体Glu的神经传导被证实是习惯化运动和目标运动技能形成的神经环路[11-12]。纹状体是脑内DA含量最高的结构,其DA含量占全脑的70%~80%,纹状体内DA水平与运动学习能力密切相关,有研究证实脑内DA水平增高可增强运动控制的神经元活性,促进耐力性运动成绩的提高[13-14]。DA系统参与技能学习与动作执行,DA对行为功能的影响存在不同胞内信号控制路径,DA与D1型受体结合可异化运动,与D2型受体结合可拮抗运动并减少多余动作。AMPA受体亚基表达改变调节参与运动技能学习相关的突触可塑性,皮层-纹状体突触后AMPA受体亚基表达改变对突触快速兴奋性传导效率(即突触传递的可塑性)起决定性作用[15-17]。AMPA受体亚基在Glu的突触传递过程中起着重要作用,其中GluR2/3在正常情况下控制Ca2,内流量,在病理状态下如帕金森病,GluR2/3的表达量下降,导致流入纹状体神经元胞内的Ca2,增多,会引起级联的兴奋性毒作用,GluR2/3介导的兴奋性毒作用被认为是帕金森病发病机制的一种[11-12]。

许多研究表明,运动可以通过促进大脑代谢水平,刺激神经的发生,从而改善正常或病理(如脑卒中或神经退行性病变)状态下的行为功能[10,15-16]。Van等的研究发现,自主跑轮运动可以促进海马神经元的发生,增强突触可塑性,是运动记忆增强的神经基础[17];Molteni等[1]的研究发现,跑台运动增强动物技能学习的同时伴随着皮层-纹状体Glu传导的改变;Tajiri等[7]采用中等强度跑台早期干预帕金森病模型大鼠发现可以减少黑质-纹状体DA的损耗,加强对大脑的神经保护作用。VanLeeuwen等[18]采用高强度间歇跑台运动强迫帕金森病模型小鼠训练,4周后发现AMPA受体GluR2/3的表达相较于病理状态显著下调,AMPA受体可能是运动改善帕金森病模型行为功能的脑内作用靶点。研究发现长期有氧运动可增加中脑及纹状体DA含量,与运动技能学习的提升密切相关[19]。纹状体内DA和Glu递质平衡对正常运动执行至关重要,纹状体主要参与运动的顺序学习和运动后期动作的自动发起[20]。本研究发现:Ex28组大鼠较对照组纹状体DA含量增高的同时伴随自主活动能力的增强,这与前人研究发现运动促进DA分泌、提高自主活动能力相一致;同时Ex7组较Control组没有显著差异,表明运动对DA含量的影响存在时间依赖效应。Ex14与Ex28组较Control组GluR1和GluR2/3亚基的表达量均有增加,提示亚基的表达与后期运动学习的突触可塑性有关这与Smith等的研究结果一致[21]。本研究进一步证实,纹状体DA和AMPA受体亚基是运动介导脑可塑性的重要作用靶点,DA含量提升和AMPA受体亚基表达的改变是运动提升大鼠运动表现的重要基础之一,可能是运动改善学习记忆、认知和行为的可塑性机制之一。

4 结束语

跑台运动可以显著提高大鼠的自主活动能力及纹状体DA含量和GluR1与GluR2/3亚基的表达水平,对纹状体神经递质含量和受体表达产生可塑性影响。推测:DA含量提升和AMPA受体亚基表达的改变不仅是运动提升大鼠运动表现的重要基础之一,而且可能是运动改善学习记忆、认知和行为的可塑性机制的重要因素。

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